高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入進樣閥的供試品，由流動相帶入柱內，各成分在柱內被分離，并依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。采用微柱液相色譜系統可以減少溶劑的消耗并達到快速分離之目的。高效液相色譜法的主要分離機制有吸附、分配、離子交換和排阻作用。  

1. 對儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規定。 （1）色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對映異構體的拆分分析。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等因素）以及色譜柱的填充，將直接影響待測物的保留行為和分離效果。孔徑在150？以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在300？以上的填料。以硅膠為載體的鍵合固定相填充劑適用pH2～8的流動相。當pH大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用pH小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機-無機雜化填充劑等。 （2）檢測器 最常用的檢測器為紫外吸收檢測器，其他常見的檢測器有二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發光散射檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外、二極管陣列、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測物的質量有關，還與化合物的結構有關；示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物結構均有響應；蒸發光散射檢測器屬質量型檢測器，對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物在規定波長范圍內的吸收光譜，故可用于待測物的光譜管制和色譜峰純度的檢查。紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測物的質量呈線性關系，但蒸發光散射檢測器響應值與待測物的質量通常并不呈線性關系，必要時需對響應值進行數學轉換后進行計算。不同的檢測器，對流動相的要求不同。當采用紫外檢測器時，所用流動相應至少符合紫外分光光度法（附錄ⅣA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發鹽組分的流動相。 （3）流動相 由于C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常不應低于5％，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體的色譜系統并達到系統適用性試驗的要求。但對某些品種，必須用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求，可在該品種項下注明。  

2. 系統適用性試驗 色譜中最難分離物質對或與其相關的物質對的分離度和待測物響應值的重復性是系統適用性試驗的重要參數。 按各品種項下要求對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品對色譜系統進行試驗和調整，應符合要求；或規定色譜條件下的最小理論板數、分離度、重復性和拖尾因子。 （1）色譜柱的理論板數（n） 在規定的色譜的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和半高峰寬（Wh/2），按n＝5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低于各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的效果等），使理論板數符合要求。 （2）分離度定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另有規定外，分離度應大于1.5。 （3）重復性 取各品種項下的對照溶液，連續進樣3～5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子。其相對標準偏差也應不大于2.0%。 （4）拖尾因子為保證測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子（T）是否符合各品種項下的規定，或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： 式中W0.05h為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，峰高法定量時T應在0.95～1.05之間。  

3. 測定法 定量測定時，可根據供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但測定雜質含量時，須采用峰面積法。 （1）內標法加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量 按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子： 校正因子式中AS為內標物質的峰面積或峰高； AR為對照品的峰面積或峰高； CS為內標物質的濃度； CR為對照品的濃度。 再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質）峰和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量： 含量式中AX為供試品（或其雜質）峰面積或峰高； CX為供試品（或其雜質）的濃度； A′S為供試品溶液中內標物質的峰面積或峰高； C′S為供試品溶液中內標物質的濃度； f為校正因子。 當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一份內標物質溶液時，CS=C′S，則配制內標物質溶液不必精密稱（量）取。 （2）外標法測定供試品中某個雜質或主成分含量 按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： 含量式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時，以定量環或自動進樣器進樣為好。 （3）加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種正文中，用于校正雜質的實測面積。這些需作校正計算的雜質，通常以主成分為參照采用相對保留時間定位，其數值一并載入各品種正文中。測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液，進樣，調節檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液中的主成分色譜峰高約達滿量程的10%～25%或其峰面積能準確積分（通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的RSD應小于10%；含量在0.5%～2%的雜質，峰面積的RSD應小于5%；含量大于2%的雜質，峰面積的RSD應小于2%）。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規定外，應為主成分保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。詳情請參考國家標準物質網 www.rmhot.com （4）不加校正因子的主成分自身對照法 當沒有雜質對照品時，可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液并調節檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規定外，應為主成分保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含量。若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離，則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質峰的校正面積。然后依法計算。 （5）面積歸一化法 由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外，一般不宜用于微量雜質的檢查。方法是測量個雜質峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各雜質峰面積及其之和占總峰面積的百分率。

東莞市精威盛實驗設備有限公司是一家專業的環保設備集成商及技術服務商，致力于為為客戶提供專業的環保解決方案，如需要更詳細的資料，請直接和我們聯系。

電話：0769-22987820

傳真：0769-22817490

Email:fst@jingweisheng88.com

      715137395@qq.com

地址：東莞市精威盛實驗設備有限公司

網站：www.slqjcy.cn